WB實(shí)驗(yàn)的基本原理及操作流程

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【實(shí)驗(yàn)原理】
一個(gè)基因表達(dá)*結(jié)果是產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì)（或酶）。因此檢測蛋白質(zhì)是測定基因表達(dá)的主要標(biāo)志，檢測蛋白質(zhì)的方法很多，除ELISA法外，也可用與檢測DNA和RNA相類似的吸印方法。前兩法有“南”和“北”之意，故本法遂被延伸稱為Western（西）印跡法，該法能用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨出與專一抗血清結(jié)合的專一性蛋白質(zhì)。將聚丙烯酰胺凝膠上分辨出的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并與*抗體共孵。*抗體專一地與待分離蛋自質(zhì)的抗原決定簇結(jié)合，然后用另一種蛋自質(zhì)，如135I-蛋白A或辣根過氧化物酶連接的山羊抗IgG檢測已結(jié)合上去的抗體。本法所需時(shí)間6小時(shí)或過夜。
蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳
幾乎所有蛋白質(zhì)電泳分析都在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行，而所用條件總要確保蛋白質(zhì)解離成單個(gè)多肽亞基并盡可能減少其相互間的聚集。zui常用的方法是將強(qiáng)陰離子去污劑SDS與某一還原劑并用，并通過加熱使蛋白質(zhì)解離后再加樣于電泳凝膠上。變性的多肽與SDS結(jié)合并因此而帶負(fù)電荷，由于多肽結(jié)合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關(guān)，因此SDS多肽復(fù)合物在聚丙烯酰凝膠電泳中的遷移只與多肽的大小相關(guān)。在達(dá)到飽和的狀態(tài)下，每克多肽約可結(jié)合1.4克去污劑，借助已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)參照物，則可測算出多肽鏈的分子量。
SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳大多在不連續(xù)緩沖系統(tǒng)中進(jìn)行，其電泳槽緩沖液的pH值與離子強(qiáng)度不同于配膠緩沖液，當(dāng)兩電極間接通電流后，凝膠中形成移動界面，并帶動加入凝膠的樣品中所含的SDS多肽復(fù)合物向前推進(jìn)。樣品通過高度多孔性的積層膠后，復(fù)合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區(qū)帶（或稱積層）。曲于不連續(xù)緩沖系統(tǒng)具有把樣品中的復(fù)合物全部濃縮于極小體積的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝膠的分辨率。
zui廣泛使用的不連續(xù)緩沖系統(tǒng)zui早是由Ornsstein（1964）和Davis（1964）設(shè)計(jì)的，樣品和積層膠中含Tris-Cl（pH6.8），上下槽緩沖液含Tris-甘氨酸（pH8.3），分離膠中含Tris-Cl（pH8.8）的。系統(tǒng)中所有組分都含有0.1％的SDS（Laemmli, 1970），樣品和積層膠中的氯離干形成移動界面的先導(dǎo)邊界而甘氨酸分子則組成尾隨邊界，在移動界面的兩邊界之間是一電導(dǎo)較低而電位滴度較陡的區(qū)域，它推動樣品中的多肽前移并在分離膠前沿積聚，此處pH值較高，有利于甘氨酸的離子化，所形成的甘氨酸離子穿過堆集的多肽并緊隨氯離子之后，沿分離膠泳動。從移動界面中解脫后，SDS多肽復(fù)合物成一電位和pH值均勻的區(qū)帶泳動穿過分離膠，并被篩分而依各自的大小得到分離。
【常用試劑】
1）30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亞甲丙烯酰胺
將30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亞甲丙烯酰胺溶于總體積為60ml的水中，加熱至37℃溶解之，補(bǔ)加水至終體積為100ml。0.45µm微孔濾膜過濾除菌，查證該溶液pH應(yīng)不大于7.0，置棕色瓶中保存。
小心：丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并可通過皮膚吸收，其作用具有累積性。稱量丙烯酰胺和N,N’-亞甲丙烯酰胺時(shí)應(yīng)戴手套和面具?？烧J(rèn)為聚丙烯酰胺無毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因?yàn)樗€可能含有少量未聚合材料。
2）4×Tris•Cl/SDS, pH8.8,
在300mlH2O中溶解91g Tris堿（1.5mol/L），用1mol/L調(diào)節(jié)pH至8.8, 補(bǔ)加H2O至體積500ml。用0.45um濾膜過濾溶液，再加入2g SDS[0.4%（w/v）]，于4℃可保存1月。
3）4×Tris•Cl/SDS, pH6.8,
在40mlH2O中溶解6.05g Tris堿（0.5mol/L），用1mol/L調(diào)節(jié)pH至6.8, 補(bǔ)加H2O至體積100ml。用0.45um濾膜過濾溶液，再加入0.4g SDS[0.4%（w/v）]，于4℃可保存1月。
4）4×SDS電泳緩沖液
Tris base 24.2 g
Glycerin 115.3 g
20%SDS 20 ml
加水至總體積1000ml。
應(yīng)用時(shí)稀釋4倍即為1×SDS電泳緩沖液（Tris 0.05M, Glycerin 0.38M, SDS 0.1%）。
5）TEMED （N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）
TEMED通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N’-亞甲丙烯酰胺的聚合。
6）10%過硫酸銨
過硫酸銨提供驅(qū)動丙烯酰胺和亞甲丙烯酰胺聚合所必需的自由基?？捎萌ルx子水配制小量10%（w/v）的貯存液并保存于4℃。由于過硫酸銨會緩慢分解，故應(yīng)隔周新鮮配制。
【操作步驟】
1）按廠商的使用指南用兩塊干凈的玻璃，平板和0.75mm墊片組裝電泳裝置中的玻璃平板夾層，并固定在灌膠支架上。
2）按表1配制分離膠液體并脫氣，然后加入10％的過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌混勻。
表1 聚丙烯酰胺分離膠的配制
試劑成分配制不同濃度分離膠所需試劑（ml）
5%8%10%12%15%
Acry:Bis （30:0.8）2.504.005.006.007.50
4×Tris•Cl/SDS, pH8.83.753.753.753.75
H2O8.757.256.255.253.25
10%過硫酸銨0.050.050.050.050.05
TEMED0.010.010.010.010.01